1. ПЦР в реальном времени: теория, варианты, возможности

Развитие молекулярно - биологических технологий

• 1868 год – первые данные о химических свойствах ДНК
• Начало 50- годов XX в. – ДНК – это линейный полимер, состоящий из нуклеотидов, состоящих из азотистого основания, пентозы и фосфатной группы. Основания бывают двух типов:  пуриновые – аденин и гуанин и пиримидиновые – цитозин и тимин.
• 1953 год – Д. Уотсон и Ф. Крик – нативная ДНК состоит из двух комплементарных полимерных цепей,  образующих двойную спираль.

Развитие молекулярно - биологических технологий

• 1955 год – Артур Корнберг – открытие в клетках фермента – ДНК-полимеразы.  ДНК-полимеразы обеспечивают репарацию и репликацию ДНК.
• 1959 год – А. Корнберг и Северо Очоа – Нобелевская премия по физиологии и медицине «за открытие механизмов биологического синтеза рибонуклеиновой и дезоксирибонуклеиновой кислот».
• 1962 год – Дж.Уотсон,  Ф.Крик и М.Уилкинс – Нобелевская премия по физиологии и медицине за установление молекулярной структуры нуклеиновых кислот и ее роли в передаче информации в живой материи.   
• 1971 год – Клеппе и соавт. – данные,  касающиеся состава ингредиентов реакционной смеси и принципы использования коротких искусственно синтезированных молекул ДНК-праймеров для получения новых копий ДНК.
• Начало 80-х годов – разработка автоматических синтезаторов ДНК.

История

Kary Mullis «Просто однажды ночью я наткнулся на решение»

• 1985 год - первая публикация, в которой использован метод ПЦР Kary Mullis и соавторов. Saiki, R.K., Scharf S, Faloona F, Mullis K.B., Horn G.T., Erlich HA, Arnheim N., 1985. Enzymatic amplification of b-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia, Science 230, 1350.
• 1993 год - Нобелевская премия в области химии Kary Mullis.
• 1992 год - первая публикация Higuchi и соавторов, в которой использован метод ПЦР в реальном времени. Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S.,  Griffith, R., 1992. Simultaneous amplification and detection of specific DNA-sequences. Bio-Тechnology 10(4), 413–417

Что такое ПЦР?

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод,  имитирующий естественную репликацию ДНК, "in vitro"  аналог биохимической реакции синтеза ДНК в клетке. ПЦР позволяет найти в исследуемом материале небольшой участок генетической информации,  заключенный в специфической последовательности нуклеотидов ДНК любого организма среди огромного количества других участков ДНК и многократно размножить его.  ПЦР позволяет получить количество ДНК, достаточное для детекции.

Область применения:

• диагностика инфекционных заболеваний;
• диагностика онкологических заболеваний;
• диагностика генетических заболеваний;
• идентификация личности;
• диагностика патогенов в пище;
• диагностика ГМО и др.

Схема ПЦР

ПЦР – циклический процесс, каждый цикл которого включает в себя три этапа,  характеризующихся определенной продолжительностью и температурным режимом.

ПЦР: состав реакционной смеси

1. Целевая ДНК из образца любой природы (известная нуклеотидная последовательность) - ПЦР-мишень, которая будет многократно копироваться в ходе реакции.

2. Праймеры – 2 искуственно синтезированных фрагмента ДНК, комплементарные районам, находящимся на противоположных нитях и фланкирующим искомую ДНК-мишень, с праймеров начинается удваивание цепи ДНК.

ПЦР: состав реакционной смеси

3.  Термостабильная ДНК- полимераза – фермент, способный удлинять цепь ДНК.
4.  Дезоксинуклеотидтрифосфаты (дАТФ,  дТТФ,  дЦТФ,  дГТФ) – «строительный материал» для синтеза комплементарной цепи ДНК.
5.  Реакционный буфер (с Mg2+) – буфер,  создающий оптимальные условия (концентрация ионов и рН) для работы ДНК-полимеразы.

Виды детеции ПЦР - амплификации

Электрофорез в агарозном геле

Детекция методом электрофореза в агарозном геле (только по конечной точке): разделение заряженных молекул (ДНК) в пористом геле в зависимости от их размера под действием электрического поля

• ДНК (ампликон)  имеет отрицательный заряд - в электрическом поле движется от «-» к «+»
• Молекулы ДНК разного размера имеют различную подвижность в агарозном геле

Размер ампликона можно оценить,  сравнив его пробег с пробегом молекул ДНК известной длины

Электрофорез в агарозном геле

Преимущества:

1. Не требуется сложного оборудования
2. Низкая стоимость реактивов

Недостатки:

1. Высокий риск контаминации (загрязнения продуктами предыдущих ПЦР)
2. Требуется дополнительное помещение и персонал для стадии детекции продукта
3. Трудоемкость
4. Только качественный анализ (есть/нет)

Флуоресцентный метод детекции

Флуоресцентный метод детекции по конечной точке (FLASH): пробирки с продуктами ПЦР анализируются специальным флуоресцентным детектором.

Преимущества:

1. Низкая стоимость оборудования для детекции
2. Низкая трудоемкость
3. Не требуется дополнительного помещения и персонала
4. Снижение риска контаминации
5. Автоматическая регистрация и интерпретация данных

Недостатки:

1. Только качественный анализ (есть/нет)
2. Более дорогие реактивы (по сравнению с форезом)

Что такое ПЦР в реальном времени (real-time PCR) ?

Флуоресцентный метод детекции в режиме реального времени
(real-time PCR):

• Определение выхода продукта после каждого цикла амплификации
• Построение по этим данным кинетической кривой ПЦР
• Определение относительной концентрации субстрата на основании анализа этой кривой

Стадия детекции совмещена со стадией амплификации.

Кинетические кривые ПЦР в реальном времени

Кинетическая кривая ПЦР в координатах "Уровень флуоресценции — цикл амплификации" имеет сигмоидную форму.

В ней можно выделить три стадии:

Стадию инициации (когда ПЦР-продукты еще не детектируются флуоресцентной меткой);
Экспоненциальную стадию (в которой наблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла ПЦР);
Плато (стадию насыщения).

Пороговый цикл (threshold cycle, C(T)) такой цикл n,  на котором достигается некий заданный уровень флуоресценции – пороговая флуоресценция.

Значение С(T) прямо пропорционально логарифму количества субстрата.

ПЦР-РВ позволяет сравнивать количества субстрата при условии,  что эффективность реакции и заданный уровень пороговой флуоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций.

Сравнение ПЦР и ПЦР - РВ

Флуоресцентные зонды

Делятся на две категории:

• использующие неструктурированные линейные зонды (TaqManTM, LightCycler, Lanthanide, EclipseTM);
• использующие структурные зонды (Molecular Beacons, ScorpionsTM , CycliconsTM).

красители на 5’ и 3’ концах зонда

один из красителей внутри цепи ( натимидине или цитидине)

Преимущества и недостатки систем ПЦР-РВ со специфической детекцией

Преимущества систем, использующих флуоресцентные олигонуклеотидные зонды:

• специфичность не ограничивается специфичностью праймеров, дополнительная специфичность за счет комплементарного зонда;
• возможность проведения мультиплексной ПЦР (до 4-х красителей);
• огромный выбор вариантов ПЦР-РВ.

Недостатки:

• сложный дизайн зондов и праймеров;
• высокая стоимость, т.к.  на каждый фрагмент требуется свой специфический зонд.

Преимущества ПЦР-РВ

Основныепреимущества

• измерение исходного количества специфической ДНК (РНК)  в исследуемом образце;
• широкий динамический диапазон от единичных до 109 копий;
• возможность сравнительного количественного анализа для нескольких различных ДНК-мишеней в одной пробирке одновременно;
• обнаружение и определение процентного содержания ДНК с измененной последовательностью;
• исключение послеамплификационных манипуляций с продуктом,  и,  как следствие,  существенное снижение риска контаминации,  сокращение времени анализа, упрощение организации ПЦР лаборатории;
• автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов.

Что необходимо для работы по технологии ПЦР в реальном времени:

• прибор для ПЦР-РВ;
• программное обеспечение;
• реактивы – наборы, тест-системы, праймеры и зонды;
• вспомогательное оборудование – центрифуги, вортексы, ламинар;
• расходные материалы – пробирки, стрипы, плашки.

2.  Определение антибиотикоустойчивости

Особенности МБТ

• медленная скорость роста возбудителей;
• внутриклеточная локализация;
• высокая плотность (концентрация) клеток патогена (М.tuberculosis) в пораженном органе – до 10 млрд на легкое;
• способность клеток к переходу в фазу отсутствия роста с реактивацией через несколько лет;
• природная резистентность к ряду антимикробных агентов.

Все это приводит к хронической инфекции с необходимостью поддержания высокого уровня лекарственных препаратов в организме больного в течение ряда месяцев,  в связи с чем обостряется проблема токсичности используемых лекарств.

Виды антибиотикоустойчивости

• Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ или MDR – Multi-Drug Resistance) – вид устойчивости МБТ к двум основным ПТП – изониазиду и рифампицину одновременно (независимо от наличия резистентности к др. препаратам). 450,000 новых случаев туберкулеза с МЛУ - ежегодно.
• Экстенсивная или широкая лекарственная устойчивость – (XDR – Extensively Drug Resistant)  множественная лекарственная устойчивость в сочетании с устойчивостью к фторхинолонам и к одному из группы инъекционных препаратов:  канамицину или/и амикацину или/и капреомицину. 27,000 новых XDR  случаев туберкулеза - ежегодно. Лечение XDR туберкулеза крайне трудно.
• Экстремальная или абсолютная лекарственная устойчивость – (XXDR – Extremely Drug Resistant) – устойчивость ко всем ПТП.  В 2007 г. - первая публикация о двух зарегистрированных случаях абсолютно устойчивого туберкулеза (XXDR) в Италии.
• Перекрестная лекарственная устойчивость – явление,  когда возникновение устойчивости к одному препарату влечет за собой устойчивость к другим ПТП.  Обусловлена сходством химической структуры некоторых ПТП.

Диагностика лекарственной чувствительности/устойчивости

Классические

• Абсолютных концентраций
• Пропорций
• Метод коэффициента резистентности «Ускоренные» методы
• Бактек-960 (пропорций)
• Молекулярно – генетические
  • ПЦР в реальном времени
  • Биочип-технология
  • Hain-test MDR-TB
  • GeneXpert

Определение антибиотикоустойчивости с помощью ПЦР-РВ

Определение лекарственной чувствительности с помощью ПЦР-РВ – определение генных мутаций, ассоциирующихся с устойчивостью к определенным противотуберкулезным препаратам.

Аллель-специфичная ПЦР: для эффективной ПЦР 3’-концевой нуклеотид праймера должен быть комплементарен соответствующему нуклеотиду  ДНК-матрицы, иначе эффективность удлинения праймера во время ПЦР резко снижается или может отсутствовать совсем.

Преимущество АС-ПЦР: позволяет получать информацию не только о наличии мутации в геномной ДНК,  но и ее аллельном распределении.

АС-ПЦР в формате реального времени – возможность одностадийного быстрого и точного анализа мутаций !

Схема метода определения мутаций на основе технологии аллель-специфичной ПЦР-РВ

Интерпретация результатов выявления мутаций на примере 531 кодона rpoB гена M.tuberculosis

Апробация технологии мультиконкурентной аллель-специфичной ПЦР

• 2005  г. – испытания шифрованных тест-культур из супранациональной лаборатории Швеции; 2008-2009 гг. – ФСВОК испытания панели образцов на антибиотикоустойчивость
• 2006 г. – мониторинг более 2000 клинических образцов культур из 25 регионов РФ
• 2007  г. – клинические испытания шифрованных образцов мокроты
• 2007-2008 г. – регистрация в ГИСК им. Тарасевича
• 2007-2008  г. – разработка тест-систем,  определяющих устойчивость к фторхинолонам, капреомицину, амикацину
• 2010 г. – получены регистрационные удостоверения на наборы М-СОРБ-ТУБ, АМПЛИТУБ-РВ, АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ

Результаты мониторинга лекарственной устойчивости по федеральным округам РФ

Сравнение ПЦР-РВ анализа и бактериологического исследования лекарственной устойчивости к RMP и INH

Совпадение результатов ПЦР-РВ и метода пропорций 99.5%

Апробация технологии мультиконкурентной аллель-специфичной ПЦР-РВ

Разработанный метод мультиконкурентной аллель-специфичной ПЦР-РВ позволяет быстро (1-3  дня) определять антибиотикоустойчивость 90-100% потенциально устойчивых штаммов со специфичностью 99-100%.

Результаты сравнительных испытаний

Уровень совпадений результатов определения лекарственной чувствительности между культуральными исследованиями и методом ПЦР-РВ составил:

• по двум типам антибиотиков (фторхинолоны и капреомицин/амикацин) – 87%
• по фторхинолонам – 84,1%;
• по капреомицин/амикацину – 89,6 %.

Чувствительность анализа методом ПЦР-РВ,  по сравнению с культуральным,  составила 90% (фторхинолоны - 90%,  капреомицин/амикацин – 90%).

Специфичность анализа – 98% (фторхинолоны - 96%, капреомицин/амикацин – 100%).

ПЦР-РВ технология

• возможность работы как с культурами, так и с клиническими образцами
• высокая специфичность метода позволяет анализировать смешанные штаммы
• автоматический расчет результатов анализа с указанием количества выявленного возбудителя в образце и конкретных мутаций,  определяющих устойчивость к определенным препаратам
• открытая система (возможность использования реагентов разных производителей,  возможность использования материала для всех задач комплексного анализа МБТ)
• требует 2 помещений при организации ПЦР-лаборатории

Выделение ДНК на примере реагентов производства компании Синтол

«М-СОРБ-ТУБ» для для ручного выделения ДНК

Сочетает сорбцию ДНК на магнитных частицах и осаждение ДНК в присутствии осаждающего реагента, специально разработан для выделения туберкулезной ДНК из клинического материала.

«М-СОРБ-ТУБ-АВТОМАТ» для автоматического выделения ДНК

Адаптирован для автоматического выделения ДНК микобактерий на роботизированных станциях TECAN

Выделение ДНК – на роботизированной станции TECAN

• снижает риск контаминации во время выделения практически до нуля
• существенно уменьшает трудоемкость процесса выделения
• экономически эффективная система (низкий расход пластика и реактивов)
• позволяет проводить стандартизированное выделение ДНК из клинических образцов
• специально разработан для выделения ДНК микобактерий из клинического материала и культуры клеток
• обеспечивает высокую эффективность выделения ДНК из клинических образцов мокроты
• выделение ДНК основано на сорбции ДНК на оригинальных магнитных частицах
• включает внутренний положительный контроль (ВПК),  позволяющий контролировать ингибирование ПЦР-РВ и эффективность выделения

Заключение

В настоящий момент в Российской Федерации, согласно Приказу № 109 министерства здравоохранения, подтверждение диагноза для всех случаев туберкулеза, так же как и контроль эффективности лечения (ежемесячно),  осуществляется методом посева.

Основным недостатком метода являются длительные сроки получения результатов (21-28 суток), обусловленные медленным ростом микобактериальной популяции.

Метод ПЦР позволяет за короткое время (несколько часов) провести одновременно качественный и количественный анализ как на сами микобактерии туберкулёза, так и на их лекарственную устойчивость.

Однако, постановка ПЦР анализа имеет высокие требования к чистоте эксперимента и профессионализму сотрудников.

Автоматическая роботизированная станция TECAN позволяет избежать многих трудностей возникающих на преаналитическом этапе, снизить до минимума риск контаминации и практически исключить «человеческий фактор».

Cкачать PDF презентацию

На главную